Hidlo Llif Diriaethol TFF Wedi'i Gyfuno ag Uwch Ganrifiad ar gyfer Paratoi Fesigl Allgellog Bach Effeithlon

Fesiglau nanoraddfa yw fesiglau allgellog bach (sEVs) sy'n cael eu secretu gan gelloedd sy'n cynnwys asidau niwclëig, proteinau, moleciwlau bach, a chydrannau eraill, ac sy'n chwarae rhan bwysig mewn cyfathrebu rhynggellog. Mae fesiglau allgellog bach o deip exosome yn debyg iawn i'w rhiant-gelloedd. O'u cymharu â nanoronynnau artiffisial, maent yn arddangos cyfraddau clirio imiwnedd is a sytowenwyndra is, gan eu gwneud yn ymgeiswyr addawol fel rhai newydd.cerbydau dosbarthu cyffuriau in vivo. Gall bron pob math o gelloedd secretu'r fesiglau hyn, ac mae ymchwil i'w cymhwyso fel cludwyr cyffuriau yn symud yn raddol o'r labordy tuag at gymwysiadau clinigol. Fodd bynnag,Mae cynhyrchu ar raddfa fawr yn dal i fod yn dagfa fawr.

 

Dulliau Presennol ar gyfer Ynysu Fesiglau Allgellog

Mae dulliau ynysu fesiglau allgellog presennol yn cynnwysuwch-allgyrchiant, centrifugiad graddiant dwysedd, cromatograffaeth gwahardd maint-(SEC), a dyodiad polyethylen glycol (PEG).

Mae dyodiad PEG yn cynnig cynnyrch uchel a gweithrediad syml, ond mae'n gysylltiedig â halogiad sylweddol gan broteinau diangen. Gall centrifugio graddiant dwysedd a maint-cromatograffaeth allgáu ddarparu cynhyrchion purdeb uchel, ond mae eu heffeithlonrwydd yn gymharol isel ac mae'r prosesau'n cymryd llawer o amser. Defnyddir ultracentrifugation yn eang, ond mae ei gyfaint prosesu wedi'i gyfyngu gan gapasiti centrifuge, gan ei gwneud hi'n anodd ei raddfa.

 

Cymhwyso Hidlo Llif Tangential ar gyfer Gwahanu sEV

Mae hidlo llif diriaethol (TFF) eisoes wedi'i gymhwyso i wahanu nanoronynnau fel liposomau a fectorau lentifeirysol. Yn TFF, mae'r porthiant yn llifo'n tangential ar draws wyneb y bilen, sy'n helpu i leihau baw pilen ac yn gwneud y broses yn haws i'w raddfa.

Gan fod fesiglau allgellog bach yn gyffredinol yn amrywio o30–200 nmmewn diamedr, acasét bilen 0.45 μmgellir eu dewis yn y system TFF i gael gwared ar broteinau a fesiglau mwy, tra bod acasét bilen 300 kDagellir ei ddefnyddio i dynnu proteinau pwysau moleciwlaidd bach a chrynhoi'r fesiglau allgellog bach sy'n bresennol yn y cyfrwng meithrin.

 

Nodweddu'r Deunydd Crai ar ôl Gwahanu TFF

Dangosodd dadansoddiad olrhain nanoronynnau (NTA) fod diamedrau'r gronynnau yn cael eu dosbarthu'n bennaf o fewn yr ystod o0–250 nm.

 

 

Fodd bynnag, datgelodd microsgopeg electron trawsyrru (TEM) lawer iawn o brotein halogedig, ac ni welwyd unrhyw fesiglau allgellog. Roedd y canlyniadau hyn yn dangos bod angen cam puro ychwanegol i lawr yr afon i buro'r fesiglau allgellog ymhellach.

 

Nodweddu'r TFF Concentrate ar ôl 100 kDa Ultrafiltration

Proseswyd y dwysfwyd TFF ymhellach gan ddefnyddio aTiwb ultrafiltration 100 kDa.

Dangosodd NTA fod y diamedrau gronynnau yn y dwysfwydydd a gafwyd ar ôl un a dwy rownd o uwch-hidlo yn aros yn bennaf o fewn yr ystod o0–250 nm. Fodd bynnag, arweiniodd perfformio ultrafiltration ddwywaith at ostyngiad sylweddol yn nifer y gronynnau a gafwyd.

Dangosodd dadansoddiad TEM na welwyd unrhyw adeileddau tebyg i fesigl yn y dwysfwyd uwch-hidlo un amser neu ddwy, tra bod cryn dipyn o brotein halogedig yn parhau.

Felly,Ni ellid defnyddio ultrafiltration 100 kDa yn effeithiol i buro'r cyfrwng diwylliant ar ôl crynodiad TFF.

 

 

Nodweddu'r Crynhoad TFF Wedi'i Buro gan Ultracentrifugation

Dangosodd NTA fod diamedrau gronynnau'r cynhyrchion wedi'u puro yn cael eu dosbarthu'n bennaf o fewn yr ystod o0–250 nm.

Yn bwysig, datgelodd TEM strwythurau tebyg i fesicle yn glir ar draws gwahanol feysydd golwg. Roedd y canlyniadau hyn yn dangos ar ôl canolbwyntio'r cyfrwng diwylliant gan ddefnyddio TFF,gellir defnyddio allgyrchiant wedi hynny i wahanu a phuro fesiglau allgellog ymhellach.

 

 

Nodweddu sEVs Wedi'u hynysu o Fôn-gelloedd Mesenchymal Cyflyru Canolig Gan Ddefnyddio TFF Wedi'i Gyfuno ag Uwch Allgyrchiant

Dangosodd NTA fod diamedrau gronynnau'r cynhyrchion wedi'u puro yn cael eu dosbarthu'n bennaf o fewn yr ystod o0–250 nm.

Arsylwyd strwythurau tebyg i fesicle gan TEM. Dangosodd dadansoddiad blotiau gorllewinol fynegiant cadarnhaol o'r proteinau cysylltiedig â fesigl allgellogCD9, CD63, ac ALIXyn y fesiglau allgellog puredig.

Cadarnhaodd y canlyniadau hyn fod y fesiglau allgellog bach wedi'u puro yn cynnwys exosomau, sy'n nodi y gellir defnyddio'r dull hwn hefyd ar gyferynysu ac echdynnu exosome.

 

 

Casgliad: TFF Wedi'i Gyfuno ag Ultracentrifugation ar gyfer Paratoadau sEV o Ansawdd Uchel

Dangosodd yr astudiaeth hynnyCrynodiad TFF yn unigarwain at gynnyrch yn cynnwys cryn dipyn o broteinau halogedig ac felly roedd yn annigonol ar gyfer cael fesiglau allgellog cymwys.

Yn yr un modd, gan ddefnyddio aTiwb ultrafiltration 100 kDa ar gyfer puro eilaiddnid oedd yn cynhyrchu strwythurau fesigl cyfan yn effeithiol.

Trwy gyfuno crynodiad TFF â phuro ultracentrifugation dilynol, gellir integreiddio manteision y ddwy dechneg i'w cael-cynhyrchion fesicle allgellog bach o ansawdd uchel.

O'i gymharu â ultracentrifugation confensiynol yn unig, gall y broses gyfuno yn effeithiollleihau'r amser prosesu cyffredinol a gwella effeithlonrwydd gwahanu.

Yn y llif gwaith hwn,Mae TFF yn galluogi cyfoethogi-samplau cyfaint mawr yn gyflym, mynd i'r afael â chyfyngiad ultracentrifugation confensiynol wrth brosesu meintiau sampl mawr. Yna mae uwch-allgyrchiant yn puro'n ddwfn i gael gwared ar amhureddau protein cyd-grynhoi tra'n helpu i gynnal purdeb a chywirdeb y fesiglau.

Ar ben hynny, nid oes angen ychwanegu at y brosesadweithyddion dyddodiad cemegol alldarddol, helpu i gadw gweithgaredd biolegol y fesiglau i'r graddau mwyaf posibl.

O safbwynt cyfieithu diwydiannol, mae gan y broses hon arwyddocaolcynyddu-potensiala gall helpu i fynd i'r afael â'r heriau sy'n gysylltiedig â-cynhyrchu fesiglau allgellog ar raddfa fawr ar gyfercyflenwi cyffuriau, meddygaeth adfywiol, a datblygu cynnyrch cysylltiedig. Mae hefyd yn darparu sylfaen arbrofol gadarn ar gyfer optimeiddio prosesau dilynol a chynnal -cynhyrchu ar raddfa arbrofol.

 

Cyfeiriad

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha, et al.Sefydlu Dull ar gyfer Gwahanu Fesiglau Allgellog Bach trwy Hidlo Llif Tangential wedi'i Gyfuno ag Uwch-ganrifiad. Chinese Journal of Biologicals, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.